【文献速递】从“共定位”到“真互作”：PLA技术揭示膜蛋白CD44与FGFR2的近距离相互作用

蛋白质之间的相互作用是细胞信号传导的重要基础。许多膜蛋白不仅作为受体发挥功能还通过与其他蛋白形成复合物调控下游信号。然而传统免疫荧光只能观察蛋白是否位于相近区域无法准确证明两个蛋白是否发生真实的近距离互作。2022年发表在 Molecular Medicine 的研究《CD44 promotes angiogenesis in myocardial infarction through regulating plasma exosome uptake and further enhancing FGFR2 signaling transduction》中研究者围绕膜蛋白CD44在心肌梗死后血管新生过程中的作用展开研究。作者发现心肌梗死后CD44表达升高并且CD44缺失会导致血管生成能力下降。CD44是否作为膜组织因子帮助FGFR2形成活化状态为了进一步证明CD44是否与FGFR2发生直接或近距离相互作用研究者采用了PLAProximity Ligation Assay邻近连接分析技术对细胞内CD44-FGFR2蛋白互作进行了原位验证。Part.01原理PLAProximity Ligation Assay是一种基于抗体识别和DNA扩增技术的蛋白近距离检测方法可用于研究细胞内蛋白质之间的相互作用。其基本原理如下1抗体识别目标蛋白首先使用两个特异性抗体分别识别目标蛋白抗CD44抗体和抗FGFR2抗体两个抗体分别连接带有DNA探针的二抗。2蛋白距离满足条件时产生信号当两个目标蛋白在空间上的距离小于约40 nm时两条DNA探针可以发生连接反应。随后通过滚环扩增Rolling Circle AmplificationRCA产生大量DNA产物。3荧光信号可视化检测扩增后的DNA产物结合荧光探针在显微镜下形成明显荧光斑点。每一个荧光点代表一次蛋白近距离事件。Part.02应用策略在该研究中作者希望回答一个关键问题CD44促进FGFR2信号激活是否依赖于两者之间的直接互作CD44-FGFR2组出现明显PLA荧光信号而阴性对照信号较低说明CD44与FGFR2在细胞内存在特异性近距离作用这一发现解释了CD44如何参与FGFR2信号调节。PLA验证原位近距离互作Zhang et al., 2022PLA应用范围膜蛋白互作研究、信号通路研究、蛋白修饰研究、细胞定位与动态研究等。PLA技术优势1.原位检测蛋白互作相比Co-IP需要细胞裂解PLA可以直接在固定细胞或组织中观察蛋白近距离关系更接近真实细胞环境。2.高空间分辨率传统免疫荧光只能观察共定位而PLA检测的是蛋白距离小于约40 nm的事件可以提供更精准的信息。3.兼容组织样本PLA不仅适用于培养细胞也可用于动物组织切片、临床样本和疾病模型研究。4.适合低丰度蛋白研究通过DNA扩增放大荧光信号即使目标蛋白表达量较低也可能实现检测。参考文献Zhang, Q., Chen, L., Huang, L. et al. CD44 promotes angiogenesis in myocardial infarction through regulating plasma exosome uptake and further enhancing FGFR2 signaling transduction.Mol Med28, 145 (2022).