CY7.7-NHS 偶联产物纯化全方案：高效去除游离 NIR-II 染料实操方法

一、实验背景与纯化核心目的

CY7.7-NHS 属于 NIR-II 近红外二区活性酯荧光探针，凭借优异长波长低背景光学性能，常用来对蛋白、多肽、抗体以及氨基修饰纳米载体开展定点共价标记，是高精度活体成像、细胞示踪实验的核心标记原料。但完成偶联孵育后，反应体系内会留存大量未参与结合的游离 CY7.7 小分子染料；这类游离杂质无靶向特异性，实验时会形成大面积弥散荧光杂信号，大幅拉低成像信噪比，直接造成观测图像失真、定量检测数据存在明显误差。为规避该类实验缺陷，标记后的产物必须经过纯化处理，完全剥离游离染料。下文针对蛋白、多肽、纳米颗粒三类最常用实验样本，整理一套操作门槛低、分离效果好、能完整保留生物活性的标准化纯化操作流程。

二、纯化前置通用准备工作

1.样本预处理：偶联反应结束后，将反应体系置换为中性PBS缓冲液，去除残留有机溶剂，避免纯化过程中样本变性、染料析出。

2.耗材预处理：根据样本分子量选择对应截留分子量的透析袋、超滤管，提前用缓冲液浸泡活化，去除耗材残留杂质。

3.环境控制：全程低温避光操作，防止CY7.7染料光降解、偶联产物变性失活，保障纯化后产物荧光活性与生物活性完整。

三、分体系标准化纯化操作方法

（一）大分子蛋白/抗体偶联产物：超滤管离心纯化法

该方法适配分子量＞10KD的蛋白、抗体偶联产物，纯化速度快、损耗低、适合小体积样本。

1. 选用对应截留分子量超滤管（截留分子量小于目标蛋白分子量），加入适量中性PBS缓冲液预润洗；

2. 将偶联反应液移入超滤管，低温高速离心，游离小分子CY7.7染料透过滤膜被去除，大分子偶联产物截留于膜上；

3. 向超滤管内补充新鲜PBS缓冲液，重复离心洗涤3-5次，彻底洗脱残留游离染料；

4. 收集膜上浓缩的纯偶联产物，避光低温保存，即可用于后续成像与检测实验。

（二）小分子多肽偶联产物：透析纯化法

适配小分子多肽偶联产物，纯化温和、无产物损耗，可彻底去除微量游离染料。

1. 选用适配小分子截留分子量的透析袋，密封一端后移入多肽偶联反应液；

2. 将透析袋置于大容量避光PBS透析液中，4℃低温避光透析；

3. 每4-6小时更换一次透析液，持续透析24小时，游离CY7.7染料可完全扩散透出；

4. 透析完成后收集袋内液体，即为高纯度多肽- CY7.7偶联产物，无游离染料干扰。

（三）纳米载体偶联产物：凝胶过滤色谱纯化法

适配脂质体、纳米胶束、聚合物纳米粒等纳米载体偶联产物，可准确分离纳米颗粒与游离染料，不破坏载体结构。

1. 提前装填Sephadex G系列凝胶色谱柱，用PBS缓冲液平衡柱体；

2. 将偶联反应液缓慢上样，匀速洗脱；

3. 纳米偶联产物分子尺寸大，优先洗脱流出；游离染料小分子保留在色谱柱内，实现完全分离；

4. 分段收集洗脱液，筛选荧光信号均匀、无游离染料污染的产物组分，完成纯化。

四、纯化效果验证方法

1. 溶液外观验证：纯化后产物溶液澄清透亮，无游离染料特征颜色残留；

2. 荧光检测验证：检测产物荧光信号均匀稳定，无游离染料快速猝灭现象；

3. 电泳/色谱验证：蛋白产物可通过电泳验证纯度，纳米产物可通过粒径检测验证无杂质干扰。

五、纯化操作避坑要点

1. 全程严格避光，防止CY7.7染料光降解，导致产物荧光活性下降；

2. 控制离心速度、透析温度，避免蛋白变性、纳米载体解体；

3. 多次洗涤/透析，杜绝微量游离染料残留，保障成像实验无背景干扰；

4. 纯化后产物现配现用，低温避光储存，避免长期放置出现染料脱落、产物降解。

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