【真实原创】犬视网膜色素上皮细胞（RPE）的提分离、培养和鉴定方案

犬视网膜色素上皮细胞（RPE）的分离

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是一种来自神经视网膜,能够分化成具有分泌功能的上皮细胞。RPE为视网膜10层结构中的最外层，位于脉络膜与视网膜之间，是由单层色素上皮细胞所构成，排列十分规则，细胞呈多角形。

材料：
1、实验动物：新生1-3d的乳犬2只
2、组织来源：眼球
3、手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）、手术刀、体式显微镜
4、消化酶：II型胶原酶
5、培养基：DMEM/F12+10%FBS+1%双抗+10ng/mL EGF(Cloud-Clone）
①DMEM/F12（Gibco，Cat#: 51500056）
②EGF（Cloud-Clone，Cat#: APA560Hu01）

实验步骤
1、75%酒精消毒新生犬，取出眼球
2、用剪刀沿角膜边缘剪开眼球，去除视网膜神经层组织，收集视网膜色素层组织
3、眼科剪剪碎组织，加入0.1%的II型胶原酶，并用移液枪吸吹散视网膜色素组织，放入培养箱中消化1h，每隔10min用移液器吹打10下
4、完全培养基终止消化，将消化液经200目筛网过滤，滤液以1000rpm离心5min，
5、弃上清，完全培养基重悬细胞沉淀，用将细胞悬液铺于已包被好的T25培养瓶中
间隔3d观察换液

四、实验过程图片

图1 视网膜色素组织

五、各阶段的小鼠大脑皮层神经元细胞照片（白光）

图3 细胞白光照片 （100X）

图4 细胞白光照片 （100X）

六、犬视网膜色素上皮细胞的免疫荧光鉴定

鉴定方法：CK-18特异性抗体免疫荧光鉴定

Figure 5 Immunofluorescence identification of Cytokeratin 18 specific antibody (×200)

Figure 6 Immunofluorescence identification of Cytokeratin 18 specific antibody (×400)

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