做蛋白标记做了几年我对His-tag的感情其实挺复杂。纯化的时候它非常好用Ni-NTA珠子一抓一个准可一旦想给His-tag蛋白挂上荧光团、生物素、PEG或者其他活性小分子能直接用的特异性方案就少得可怜。你当然可以拿EDC/NHS去修饰表面赖氨酸也可以拿马来酰亚胺去做Cys但这些反应的化学选择性都建立在氨基酸丰度上一个蛋白表面十几二十个赖氨酸最后往往是一大坨未知分布和活性损伤。NTA-Alkyne次氮基三乙酸-炔烃这类试剂真正吸引我的地方在于它把NTA-Ni(II)对His-tag的结合能力和点击化学的生物正交性拼到了一起让我可以在生理条件、大致位点可控的前提下给His标签蛋白做标记。这篇就把我从试剂准备到数据处理完整跑通的方案整理出来适合需要做His-tag蛋白标记、细胞裂解物富集以及表面偶联的同学参考。1. NTA-Alkyne要解决的实际问题His-tag标记为什么需要一座点击化学的桥1.1 His-tag的“识别”和“偶联”是两回事很多人第一次听说NTA-Alkyne时会有一个误解以为它可以直接把荧光探针共价打在蛋白上。实际上要分清楚His-tag体系解决的是“识别”问题NTA-Ni(II)通过与组氨酸咪唑基团的配位结合抓到蛋白而点击化学解决的是“共价偶联”问题炔基和叠氮在铜催化下生成稳定的三唑环。NTA-Alkyne是中间那一座桥一头靠着NTA拉住His-tag另一头伸出炔基等待叠氮探针。这也意味着最终形成的标记严格来说是一个“非共价锚定 共价连接”的复合体系NTA-Alkyne与叠氮探针之间是牢固的三唑共价键但这个NTA-Alkyne-探针分子整体是靠NTA-Ni(II)和His-tag之间的配位作用待在蛋白上的。这个性质决定了它不适合那些需要剧烈洗涤、高温变性后还要保留信号的场景但在荧光成像、活细胞表面标记、Pull-down富集、蛋白原位招募这些场景里它非常实用因为条件温和、操作快、解离可控。1.2 NTA-Ni(II)结合His-tag的化学基础NTA本身是一个四齿螯合剂次氮基三乙酸上有四个可配位位点。它与Ni2结合后Ni2的配位球还空出两个位点恰好能和His-tag上相邻的两个组氨酸咪唑氮形成配位。六个组氨酸的连续序列会大幅提高这个相互作用的表观亲和力这也是Ni-NTA纯化能成为行业标准的原因。需要注意的是单个NTA-Ni(II)和His6的结合常数并不像链霉亲和素-生物素那么夸张解离常数大概在微摩尔级别。所以用的时候不能加一两当量就觉得够了一般要2到10倍摩尔过量的NTA-Alkyne去推动结合平衡。对结合稳定性要求特别高的体系可以改用Tris-NTA结构的三叉NTA或者后续用光交联把复合物固定住。但如果你只是做成像或者非变性条件下的标记单个NTA-Alkyne的亲和力基本够用。1.3 NTA-Alkyne在整体设计里的角色NTA-Alkyne在实验里有三张牌可以打。第一张是“桥梁”。His-tag蛋白本身没有可点击的官能团NTA-Alkyne负责把炔基带到蛋白附近叠氮探针通过CuAAC连到炔基上之后整个探针系统就通过金属配位锚在了His-tag区域。第二张是“间隔臂”。很多商品化NTA-Alkyne带有一段PEG连接链这能减少探针和蛋白表面的空间位阻也让水溶性变好。第三张是“正交标签”。CuAAC反应叠氮和炔基在生物体系里几乎不存在内源反应所以在一堆细胞裂解物里也能特异性地给His-tag蛋白做标记。这个分子看起来简单但实际实验里从缓冲液到加样顺序每一步稍微偷懒一点最后背景信号就会高到让你怀疑人生。下面我按自己踩出来的经验顺序讲。2. 动手前的试剂选型与缓冲液设计先把翻车概率压到最低2.1 NTA-Alkyne的溶解和储存NTA-Alkyne目前的商品化形式通常带有PEG间隔臂比如NTA-PEG4-Alkyne或者小分子形态的NTA-propargyl amide。带PEG的水溶性会好一些可以直接用超纯水或HEPES缓冲配成母液不带PEG的则优先用DMSO配成10到100 mM的母液再分装冻存。我自己的习惯是配完之后用NMR或LC-MS确认一次分子量和纯度。NTA类化合物放置久了比较容易水解或者吸潮尤其是在DMSO里反复冻融。建议每管分装成一次用量-20℃避光保存取出后一次用完。DMSO母液在反应里的终浓度尽量控制在1%到2%以内超过5%会明显影响蛋白稳定性和CuAAC效率。2.2 缓冲体系的选择优先HEPES而不是Tris/PBS缓冲液是第一个容易被忽略的坑。我最早用Tris缓冲跑CuAAC反应效率始终很低后来才意识到Tris分子上的氨基会和Cu2配位等于和THPTA配体抢铜离子。磷酸盐缓冲液则是另一个麻烦磷酸根在高浓度Cu2或Ni2存在下容易形成沉淀尤其样品里金属离子加得比较多的时候。我的推荐是20 mM HEPESpH 7.4加150 mM NaCl这是NTA-Alkyne实验里最省心的组合。HEPES对铜离子的配位能力很弱对Ni2结合His-tag也没有明显干扰。NaCl的意义在于降低探针和蛋白、探针和管壁之间的非特异静电吸附。下表是我的常用缓冲体系参考成分工作浓度作用HEPES20 mM提供稳定的pH环境不与Cu/Ni强配位NaCl150 mM屏蔽非特异静电吸附甘油0~10%稳定蛋白但不加也可以咪唑0~10 mM抑制非特异结合浓度高会竞争His-tagTriton X-100/Tween-200.01%~0.1%减少疏水探针的聚集需测试是否会抑制反应需要特别提醒很多人会把咪唑直接加在缓冲液里用来减少杂蛋白背景但如果咪唑浓度超过20 mM它就会和His-tag竞争NTA-Ni(II)上的配位位点导致NTA-Alkyne结合率明显下降。做结合步骤时我一般把咪唑控制在10 mM以下只有到了想验证特异性的阴性对照组才把咪唑加到200 mM去把His-tag竞争下来。2.3 Ni2的用量和预络合的意义NTA-Alkyne要发挥作用必须先与Ni2形成NTA-Ni(II)-Alkyne复合物。很多人图省事把NTA-Alkyne、NiCl2、蛋白、叠氮染料一股脑全加进EP管里这样也不是完全不能反应但结果往往不可控。游离的Ni2会与蛋白表面的组氨酸、半胱氨酸发生非特异结合也可能和Cu2产生置换最后凝胶上一堆杂带。我的做法是预先络合用超纯水配制100 mM NiCl2或NiSO4母液和NTA-Alkyne按1.2比1的摩尔比混合室温放置15分钟。Ni2稍微过量一点可以保证NTA全部被饱和但过量太多也会有问题后面点击化学阶段会和Cu体系产生干扰。如果样品对游离Ni2敏感可以用脱盐柱把过量Ni2去掉但这样会损失一部分NTA-Alkyne得根据回收体积重新定量。还有一个容易忽略的点是金属母液的纯度。NiCl2、CuSO4这类试剂如果长期敞口放置会有不少金属杂质和灰尘。建议用超纯水现配现用或者配好后用0.22微米滤膜过滤不然杂金属离子会和NTA、THPTA竞争配位。2.4 叠氮探针的选择与溶剂控制叠氮探针是另一个变量。FAM-azide、Cy5-azide、Biotin-azide、TAMRA-azide这些我都用过选择时主要看两点激发/发射波长是否能避开样品自身荧光以及叠氮小分子的水溶性。叠氮荧光素这类分子比较疏水通常要用DMSO配成10到50 mM母液。加进反应体系后疏水探针容易和蛋白发生非特异结合尤其是和NTA-Alkyne混合后如果出现沉淀多半就是探针聚集了。我的习惯是先把叠氮探针和反应缓冲液单独混合并稍微超声或用移液器吹打确认没有浑浊再加入蛋白体系。如果样品里有比较严重的疏水非特异结合可以加少量Tween-20到0.01%到0.05%但含Tween体系的CuAAC效率偶尔会下降需要做一个“有Tween”和“无Tween”的预实验对比。3. CuAAC反应条件的用量逻辑从铜源、THPTA到抗坏血酸钠3.1 CuAAC反应机制里真正重要的是Cu(I)CuAAC反应的催化核心是Cu(I)它和端炔形成铜-乙炔配合物再与叠氮反应生成五元环中间体最终释放出1,4-取代的三唑。这里有个看起来很反常识的点叠氮和端炔在没有催化剂时也能反应但速度极慢在生物样品温度下基本可以忽略。所以“不加NaAsc只加CuSO4”的对照组理论上不应该有产物这是验证特异性的基础。Cu(I)本身不稳定在水中容易歧化成Cu(0)和Cu(II)所以必须用配体把它稳定住。THPTA是目前蛋白标记里最常用的配体亲水性好、毒性低、能加速反应。也有用BTTAA的BTTAA在活细胞环境里更友好动力学也更快但在体外试管反应里THPTA对大多数蛋白体系都够用价格也更便宜。3.2 加样顺序和推荐配方我踩过的最大一个坑是把CuSO4直接加到含蛋白的Buffer里结果瞬间出现蓝色沉淀蛋白也跟着析出。原因是pH 7.4附近Cu(OH)2很容易沉淀。正确的做法是先把CuSO4和THPTA混合让铜先被配体抓住形成水溶性的蓝色铜-配体复合物然后再加抗坏血酸钠把Cu(II)还原成Cu(I)。这套顺序做好了后面几乎不会出现沉淀。一个可以直接套用的100微升反应体系配方成分储备液浓度加入体积终浓度HEPES缓冲液20 mM HEPES, 150 mM NaCl补足100 μL-His-tag蛋白10 μM10 μL1 μMNTA-Alkyne-Ni2200 μM10 μL20 μMFAM-azide200 μM10 μL20 μMCuSO4/THPTA预混液CuSO4 2 mM, THPTA 10 mM10 μLCu 200 μM, THPTA 1 mM抗坏血酸钠50 mM10 μL5 mM实际操作时我会先把CuSO4和THPTA按1比5的摩尔比混合室温放置5分钟看到溶液变成澄清的蓝色再加入抗坏血酸钠溶液颜色会迅速变浅这时尽快加入反应体系。抗坏血酸钠一定要新鲜配制用超纯水配成100 mM或50 mM母液配完后注意调节pH到中性附近。如果母液颜色发黄说明已经部分氧化降解需要重新配。3.3 Cu、配体、还原剂的浓度为什么这样定很多文献里CuSO4浓度动辄500 μM甚至1 mM但到了NTA-Alkyne体系里我建议控制在100到250 μM。原因很简单体系里本来就有大量NTA结构NTA既可以螯合Cu(II)也可以螯合Ni(II)过量的铜会干扰NTA-Ni(II)与His-tag的结合。THPTA浓度我习惯保持在Cu的5倍上下这样既能把铜稳定住又不会因为THPTA过量到抑制反应。抗坏血酸钠5 mM是一个比较稳的中间值太低还原不彻底太高会带来大量氧化产物和蛋白上的氨基发生非特异交联。还要注意加样后尽快混匀但不要涡旋剧烈震荡。Cu(I)-THPTA体系遇氧气会失活盖上盖子室温反应30到60分钟即可。时间太长并不会让效率线性上升反而会增加铜对蛋白的损伤。如果反应体积比较大可以放在摇床上低速晃动保证扩散均匀。3.4 反应温度和氧气控制试管内CuAAC通常在室温或冰上进行。蛋白样品不稳定时用冰浴加长时间比如4℃反应1到2小时蛋白稳定且需要快出结果时室温30分钟就够了。我个人在NTA-Alkyne实验里偏向4℃或室温短时间因为Ni-NTA-His配位本身是放热过程太高温度反而增加解离。对氧气的控制不需要像无氧合成那样严格但也要避免长时间敞开。可以从两个角度看一是Cu(I)容易被氧气氧化导致催化活性下降二是抗坏血酸钠在空气中耗氧产生活性氧可能引发蛋白氧化。用封口膜封住EP管口或者用带密封圈的离心管就足够了。我曾经试过通氮气保护效果有一定提升但对一般蛋白标记实验来说属于可做可不做的加分项。4. 完整实验流程络合、结合与点击的三种顺序4.1 顺序A先络合NTA-Ni(II)再结合蛋白最后点击这套顺序是我在体外纯化蛋白上最常用的因为操作最简单控制变量最清晰。第一步制备NTA-Alkyne-Ni(II)复合物。取NTA-Alkyne母液与NiCl2按1比1.2的摩尔比混合在HEPES缓冲里室温静置15分钟。如果使用带PEG的商品化NTA-Alkyne通常这一步就能得到澄清溶液如果出现沉淀先检查是不是pH偏碱或者NiCl2浓度过高导致氢氧化镍生成。第二步结合His-tag蛋白。把His-tag蛋白和NTA-Alkyne-Ni(II)复合物按照蛋白与探针摩尔比约为1比5到1比20混合4℃或室温孵育30分钟。这里蛋白浓度不要太高建议1到20 μM过高容易聚集过低则后续荧光信号的绝对强度不足。第三步加叠氮探针。FAM-azide或Cy5-azide母液用DMSO配好按蛋白摩尔数5到10倍加入反应体系混匀。第四步加CuSO4/THPTA预混液和新鲜抗坏血酸钠启动点击反应。室温避光反应30到60分钟。第五步终止和纯化。加入EDTA到5 mM可以把游离的铜和镍都螯合掉再用Zeba脱盐柱或透析除去未反应的叠氮染料和NTA-Alkyne。如果不做后续细胞实验也可以直接点样跑SDS-PAGE观察。4.2 顺序B先把NTA-Alkyne和叠氮探针Click了再接蛋白如果目标蛋白对铜离子特别敏感或者你的实验不允许在蛋白附近有Cu(I)我建议用顺序B先让NTA-Alkyne和叠氮探针发生CuAAC生成一个“NTA-三唑-荧光探针”的完整探针分子纯化后再络合Ni2最后加到His-tag蛋白样品里。这个流程的优点是蛋白全程不接触铜。缺点是NTA-Alkyne和叠氮探针反应完后需要去除多余的CuSO4、抗坏血酸钠和未反应的叠氮分子否则后续可能会带来背景信号。小分子之间点击产物的纯化可以选择反相HPLC或固相萃取如果没有HPLC条件至少要用脱盐柱或透析把大分子杂质去掉再用LC-MS确认产物。顺序B还有一个好处可以先做一个“储液库”。提前把不同颜色的叠氮荧光素分别接到NTA-Alkyne上做成NTA-FAM、NTA-Cy5、NTA-Biotin然后分装冻存后续做多色标记实验非常方便。类似的做法其实在很多NTA探针试剂盒里已经标准化了。4.3 顺序C先让蛋白和叠氮探针结合再用NTA-Alkyne点击顺序C是我在特殊场景下用过的一个变体先把叠氮修饰试剂通过其他方法偶联到蛋白上然后让NTA-Alkyne带着Ni2去点击这个叠氮蛋白从而把NTA体系“装”到蛋白上。这样做适合已经完成叠氮标记的蛋白进一步接上亲和标签的场景。但说实话这种顺序不如前两种常用因为它要求蛋白上已经存在叠氮基团而叠氮修饰本身又是一个单独的工程。三种顺序怎么选我归纳了一个很简单的判断方式场景推荐顺序原因普通体外His-tag蛋白荧光标记A操作快信号强蛋白对铜敏感/容易变性B先完成点击蛋白不接触Cu已经有叠氮化蛋白需要接NTA亲和标签C直接从叠氮端入手活细胞表面标记B后应用可避免Cu体系也可换SPAAC4.4 一个可以直接照抄的100 μL标记体系这里给一份我最近做过His-tag-GFP标记的完整记录。蛋白浓度2 μM标签为N端His6探针为NTA-PEG4-Alkyne和FAM-azide。NTA-PEG4-Alkyne母液10 mM取2 μL加入含0.2 μL 50 mM NiCl2的100 μL HEPES缓冲中室温预络合15分钟。这一步NTA终浓度约200 μMNi2略过量。加入10 μL浓度为20 μM的His-GFP使蛋白终浓度约2 μM4℃摇床孵育30分钟。加入8 μL浓度为250 μM的FAM-azide母液使探针终浓度约20 μM混匀。配制CuSO4/THPTA预混液CuSO4 10 mM 2 μL THPTA 50 mM 2 μL用缓冲液补到20 μL室温放置5分钟。加入10 μL新鲜配制的抗坏血酸钠50 mM立即混匀并快速加入反应管室温避光反应40分钟。加入2 μL 0.5 M EDTA终止用Zeba脱盐柱7 kDa截留换液到HEPES缓冲。取10 μL样品加入非还原型样品缓冲液不煮沸直接跑Native-PAGE或温和SDS-PAGE先做荧光扫描再考马斯亮蓝染色。这个体系跑下来阳性管里His-GFP条带上有清晰的绿色荧光阴性对照基本干净。如果换成Cy5-azide波长不同操作完全一样。5. 结果表征与特异性验证荧光、质谱和对照组5.1 荧光SDS-PAGE怎么读标记完成后最直接的验证手段是荧光凝胶扫描。对NTA-Alkyne体系来说有一个需要特别提醒的细节不要用常规方式把样品煮沸后再上样。SDS-PAGE的loading buffer里有SDS和还原剂加热会完全破坏His-tag和NTA-Ni(II)的配位探针会从蛋白上解离荧光信号可能已经不在目标条带位置。我的经验是用Native-PAGE或者温和型SDS-PAGE上样前不煮沸也不加高浓度DTT或β-巯基乙醇。如果你保留了一部分样品做煮沸处理会看到一个很有意思的现象煮沸后的样品荧光信号大幅度下降甚至完全消失。这说明标记不是共价连接蛋白而是通过NTA-Ni(II)-His配位锚定的。这个现象本身也可以当作一个配位特异性的佐证但它确实提醒我们这套方案不适合需要变性条件下稳定保留信号的场景。荧光扫描之后还要考马斯亮蓝复染确认蛋白上样量一致避免出现“荧光强只是因为蛋白上样多”的误判。我通常会把荧光灰度值对考马斯亮蓝染色的灰度值做归一化再进行不同条件之间的比较。5.2 质谱确证小分子层面和蛋白层面分开看要证明NTA-Alkyne和叠氮探针真的发生了共价点击最可靠的做法是做一个不包含蛋白的小分子层面反应用LC-MS直接检测产物分子量。比如NTA-PEG4-Alkyne和FAM-azide反应后产物应该比两个反应物质量之和小因为脱去了N2。质谱上如果能清晰看到新分子的[MH]或[MNa]峰点击反应的化学本质就坐实了。对于蛋白层面的验证要用非变性质谱或温和ESI条件才有可能看到蛋白与NTA探针复合物形成的质量增加。常规ESI通常会破坏Ni-NTA-His配位所以蛋白图谱上看不到稳定加成就不要急着否定实验先检查小分子LS-MS结果和荧光成像结果。另一个思路是用pull-down验证把生物素-叠氮探针通过CuAAC接到NTA-Alkyne上再与His-tag蛋白结合用链霉亲和素磁珠去捕获洗脱后用Western blot检测His-tag。如果整体逻辑成立只有同时加了NTA-Alkyne、生物素-叠氮和Cu催化体系的样本才能被磁珠拉下来。这个方法对环境比较宽容适合细胞裂解物这类复杂样本。5.3 三个必不可少的阴性对照我对每个NTA-Alkyne实验都会做三组阴性对照缺一个都容易被审稿人或合作者追问。第一组是“不加CuSO4”。缺少铜催化剂时叠氮和端炔基本不反应所以加入FAM-azide后不应有荧光标记。如果这组出现荧光信号说明叠氮染料本身发生了非特异吸附或自发反应。第二组是“不加NTA-Alkyne”。这组能检测叠氮荧光探针是否直接黏附在蛋白上尤其在疏水探针体系里很关键。第三组是“加200 mM咪唑竞争”。咪唑会和His-tag争夺Ni2配位位点如果NTA-Alkyne探针真的是靠His-tag锚定的这组荧光信号应该显著下降甚至消失。如果加了咪唑荧光依旧很强那信号多半来自非特异吸附或不参与NTA配位的其他结合模式。有条件的话我还会加一个“无His-tag蛋白对照”比如把目标蛋白换成同样的蛋白但不带His标签用来排除探针的非特异结合。5.4 特异性失败时的排查思路如果你发现最终的荧光信号在几组对照都差不多不要直接怀疑试剂有问题先按顺序排查看缓冲液是不是用了Tris或高磷酸盐缓冲铜被络合或形成沉淀看Ni2NTA是否真的饱和了Ni2如果NTA-Alkyne没有事先络合Ni2游离NTA会直接螯合Cu2甚至可能抑制反应看THPTA配体THPTA溶液是否过期或者配错浓度THPTA放久了吸潮会导致实际浓度大幅下降看叠氮探针DMSO母液是否反复冻融叠氮基团是否发生还原或水解看还原剂抗坏血酸钠是否新鲜pH是否太低。我遇到过很多次“样品和阴性对照一样亮”的情况最后排查下来都是抗坏血酸钠母液用了隔夜配的颜色已经变黄点击反应基本没有发生所有信号都来自叠氮探针的非特异吸附。这个坑不踩一次很难长记性。6. 实操中反复踩到的坑铜镍置换、假阳性、沉淀与后处理6.1 铜离子会不会抢走NTA上的镍这是NTA-Alkyne体系特别容易被人追问的一个点。从热力学上看Cu2和NTA的络合常数略高于Ni2这意味着如果体系里有大量游离Cu2它确实有驱动力置换掉NTA上的Ni2。NTA一旦转成Cu-NTAHis-tag的结合能力就会下降标记效率也会受影响。但实际操作中这个问题远没有想象中那么可怕原因在于CuAAC体系里的铜很快就从Cu(II)被还原成Cu(I)而Cu(I)对NTA的络合能力并不占优同时THPTA会竞争稳定住Cu(I)。也就是说只要CuSO4不过量、THPTA用量足够铜置换镍的破坏作用就可控。我的建议是铜的终浓度不要超过250 μM而且所有加样顺序都按“NTA先和Ni2预络合再加蛋白最后加铜体系”来执行。如果反应后检测标记效率偏低同时发现蛋白从Ni-NTA柱上更容易脱落就要怀疑铜置换立刻把CuSO4浓度降下来。在极端敏感样品里直接改用顺序B先在无蛋白体系里完成点击反应再从根源上避开问题。6.2 叠氮染料的非特异吸附和假阳性这类实验的假阳性绝大多数不是点击反应本身的问题而是叠氮荧光素太疏水。尤其FAM类探针哪怕没有NTA-Alkyne它也会往蛋白疏水口袋和表面赖氨酸群上粘。这种吸附信号在荧光扫描上看就是很均匀的亮带特别容易和真实标记混淆。抑制假阳性有几种实用手段。首先把叠氮探针和蛋白的摩尔比控制在5到10倍不要盲目追求高浓度其次在缓冲液里适当加NaCl和少量非离子去污剂比如0.02%的Tween-20能够显著减少疏水吸附再次一定要保留“不加NTA-Alkyne”和“加咪唑竞争”的阴性对照。如果吸附问题实在严重可以考虑换更亲水的叠氮探针或者使用叠氮-PEG3-生物素这类带PEG链的探针。6.3 沉淀、发黄和蛋白聚集CuAAC体系里最常见的三个异常现象溶液变浑、抗坏血酸钠母液发黄、蛋白聚集成絮状。溶液变浑多数是铜沉淀或蛋白沉淀导致。如果加CuSO4时没有先和THPTA混合很快就会看到蓝色浑浊这个只能重做没有补救。如果加了THPTA还是沉淀考察THPTA的浓度是否足够曾经的实验里THPTA:Cu低于2:1时铜沉淀的概率会明显升高。抗坏血酸钠母液发黄是氧化降解的典型信号。配完后在4℃避光放置当天用完不要过夜。发黄的母液会导致反应效率下降同时产生大量羧基降解产物反而增加背景。蛋白聚集成絮状的原因很多铜浓度偏高、有机溶剂比例偏高、蛋白本身不稳定或浓度过高。解决思路是降低铜浓度、把DMSO比例控制在2%以下、加0.5到1 mg/mL BSA或10%甘油作为保护剂。需要注意的是BSA本身含有大量组氨酸富集表面可能作为背景蛋白被NTA-Alkyne抓住所以BSA只适合在不需要看低分子量杂带的实验中使用。6.4 反应后的淬灭、脱盐和存放CuAAC结束后反应体系里还残留铜、镍、抗坏血酸、未反应的叠氮探针。如果直接拿去成像或做下游实验会对细胞或动物产生毒性也会造成背景信号。我习惯用EDTA淬灭使EDTA终浓度到2到5 mM室温放置5分钟再用脱盐柱把体系置换到HEPES缓冲或者PBS里。脱盐后的样品如果当天不用可以加10%甘油液氮速冻后-80℃保存。但要注意冷冻会改变金属配位平衡和蛋白状态NTA-Ni-His复合物在冻融过程中可能有部分解离建议每次实验前重新评估信号强度。如果要长期储存探针溶液本身最好以冻干粉形式保存在-20℃溶解后的液体不建议超过一周。6.5 从蛋白标记到表面固定的扩展思路NTA-Alkyne不只用在溶液里。把NTA-Alkyne接到叠氮修饰的表面或纳米颗粒上再利用NTA-Ni(II)去捕获His-tag蛋白是一种非常常见的蛋白定向固定策略。比起随机吸附这样固定的蛋白取向更统一活性保留也更好。操作上只需要把叠氮化的珠子或玻片和NTA-Alkyne、铜催化体系一起孵育洗涤后络合Ni2再加入His-tag蛋白即可。如果是在活细胞表面做标记铜的毒性会是一个比较大的限制。即使THPTA能减轻一部分毒性很多细胞系在铜暴露后活力也会下降。针对这种情况更合适的方案是换成无铜的SPAAC体系比如NTA-DBCO和叠氮修饰探针的组合。虽然标题里的是NTA-Alkyne但掌握了CuAAC的逻辑再换到SPAAC就只需要调整配体和反应条件整体实验设计框架是通用的。我做这类标记实验到现在最深的体会是NTA-Alkyne本身并不难用难的是把“NTA结合”“金属络合”“点击反应”三套平衡放在同一个管子里同时维护。只要理解了镍、铜、锌这些金属离子在这个体系里各占什么位置加样顺序不乱对照做得足够完整大部分问题其实都能提前挡住。器械可以慢慢补齐但逻辑想通了实验就能少走很多弯路。