兔膀胱上皮BEC细胞的原代培养一、简介膀胱为重要的排尿器官其组织结构与尿道基本相似分为三层即黏膜、肌层和外膜。膀胱的黏膜层呈粉红色由移行上皮细胞组成布满整个膀胱的最里层向上与输尿管黏膜层、向下与尿道黏膜层相延续。黏膜形成许多皱襞仅膀胱三角处的黏膜平滑。膀胱充盈时皱襞减少或消失。膀胱空虚时变移上皮很厚约8~10层细胞表层盖细胞大呈矩形膀胱充盈时上皮变薄仅3~4层细胞盖细胞也变扁。固有层含较多弹性纤维。肌层厚由内纵行、中环行和外纵行三层平滑肌组成各层肌纤维相互交错分界不清。中层环行肌在尿道内口处增厚为括约肌。外膜除膀胱顶部为浆膜外多为疏松结缔组织。二、材料1、实验动物6-8月龄新西兰大白兔1只雌雄不限2、组织来源膀胱3、手术器材手术剪镊、解剖镊、眼科剪镊4、消化酶中性蛋白酶链霉蛋白酶E5、培养基DMEM/F1210%FBS1%P/S5ng/mlEGF和50nmol氢化可的松①DMEM/F12GibcoCat#: 51500056②EGF(Cloud-CloneCat#:APA560HU026、包被鼠尾胶原I翊圣Cat#:40125ES10)三、实验步骤1. 培养瓶的包被按照2ug/cm2将鼠尾胶原I加入T25培养瓶中以覆盖培养板底部为准37℃培养箱内放置30min临用前用PBS清洗2次于超净台中晾干备用。2. 空气栓塞法处死兔子取完整的膀胱去除多余的脂肪和血管。3. 将膀胱翻转后用含2%双抗的PBS将内容物涮洗干净重复3次。4. 待膀胱清洗干净后用消毒灭菌后的棉绳将膀胱口扎住然后将整个组织转入含0.15%链霉蛋白酶E的消化液中4℃过夜消化。5. 次日拿出轻缓颠倒翻转10~12次继续4℃消化静置30~60min。6. 加入10%FBS培养基终止消化摇晃12次收集上清此步骤重复3次。7. 将三次收集到的上清经200目筛网过筛后1000rpm离心5min。8. 弃上清细胞沉淀用完全培养基重悬均匀接种在用鼠尾胶原包被的培养板中。9. 48h后镜下观察细胞当大部分贴壁时更换培养基去除悬浮的细胞之后每3天更换新鲜的培养基。待细胞生长覆盖底部80%以上时可进行传代或冻存。实验过程图片图1 开腹后暴露出膀胱图2 取出膀胱图3 去除脂肪和血管的膀胱图4 翻转并扎袋消化中的膀胱五、各阶段的膀胱上皮细胞照片白光图5、6 原代培养第3天有大量上皮细胞样长出呈岛屿状向四周伸展100X、200X图5 100X图6 200X兔膀胱上皮细胞荧光鉴定备注云克隆提供此Protocol同时适用于猫、犬、羊等物种。