蛋白互作是生命活动的核心机制之一，也是国自然基金项目中“机制研究”的关键突破口。然而，如何选择最合适的研究方法，既能满足创新性要求，又能让评审专家眼前一亮？

PS：国自然对于蛋白互作的证据一般需要2-3种阳性实验结果，建议同时包含体内外水平验证结果。

本期为大家介绍10种无需特殊仪器设备的蛋白互作检测方法主要包括Co-IP、Pull-down、酵母双杂交、荧光共定位、双分子荧光互补、荧光素酶互补、荧光共振能量转移、邻位连接、邻近标记以及酶联免疫吸附实验。

（体内水平，加分指数☆☆☆）

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）基于抗原-抗体特异性结合原理，使用靶蛋白特异性抗体捕获靶蛋白复合物，经离心沉淀、洗涤和洗脱过程获得纯化的靶蛋白-互作蛋白复合物，实现复杂样本中目标蛋白的富集及相互作用验证。

✅技术流程

（1）收集细胞并裂解提取总蛋白；

（2）特异性抗体富集目的蛋白复合体；

（3）磁珠（Protein A/G）捕获抗体-目的蛋白复合体；

（4）洗涤液洗涤磁珠；

（5）洗脱液洗脱蛋白复合体；

（6）Western blot检测或者质谱鉴定。

✅技术优势

🔥体内天然状态下验证互作，接近正常生理水平；

🔥蛋白处理细胞生理环境下，避免人为干扰；

🔥分离天然状态下的蛋白进行功能检测。

（体外水平，加分指数☆☆☆）

GST Pull-down技术将已知蛋白与GST标签融合表达纯化并固定在含谷胱甘肽（GSH）的琼脂糖珠形成已知蛋白-GST-GSH-琼脂糖珠复合体，随后与蛋白样本共孵育，捕获与已知蛋白相互作用蛋白并进行Western blot检测或者质谱鉴定。

✅技术流程

（1）利用蛋白表达系统体外表达并纯化GST融合蛋白；

（2）收集细胞并裂解提取总蛋白；

（3）将总蛋白溶液与固定在GSH-琼脂糖珠上的GST融合蛋白共孵育；

（4）收集并洗涤琼脂糖珠；

（5）洗脱液洗脱蛋白复合体；

（6）Western blot检测或者质谱鉴定。

✅技术优势

🔥直接验证蛋白相互作用，证据扎实；

🔥蛋白标签与固相支持物亲和力强，洗脱纯度高；

🔥无需抗体，亲和作用结合，富集效果好；

（体内水平，加分指数☆☆）

酵母双杂交（Yeast Two Hybrid, Y2H）技术将已知的诱饵蛋白X与BD结构域融合表达，捕获蛋白Y与AD结构域融合表达。若蛋白A和蛋白B存在互作，则BD和AD在空间上会靠近，成为有活性的转录激活因子，激活下游报告基因表达。

✅技术流程

（1）制备酵母感受态细胞；

（2）构建目的蛋白-BD和待测试蛋白-AD融合表达质粒；

（3）将表达质粒转化至酵母感受态细胞并培养；

（4）利用三缺和四缺平板进行结果鉴定；

✅技术优势

🔥基于报告基因表达产物累积效应，检测灵敏度高；

🔥可用于检测弱蛋白相互作用或者瞬时相互作用；

🔥无需抗体或者蛋白纯化操作；

🔥相对其他方法，成本较低；

（体内水平，加分指数☆）

荧光共定位（Fluorescence Colocalization, FC）技术将目的蛋白和待测试蛋白分别利用不同荧光信号进行标记，通过观察荧光显微镜下不同荧光信号的位置判断蛋白是否互作。

✅技术流程（荧光共定位）

（1）分别构建带有不同荧光标签的目标蛋白和待测试蛋白表达质粒；

（2）将表达质粒转染至细胞并培养；

（3）荧光显微镜观察荧光信号定位情况；

✅技术流程（免疫荧光共定位）

（1）细胞培养至合适密度后固定处理；

（2）使用特异性抗体分别结合目的蛋白和待测试蛋白；

（3）使用带有不同荧光标记的二抗对目的蛋白和待测试蛋白进行标记；

（4）经洗涤后，使用荧光显微镜观察荧光信号定位情况；

✅技术优势

🔥操作简单，成本低；

🔥蛋白互作信号可视化；

🔥可用于组织切片互作检测；

（体内水平，加分指数☆☆）

双分子荧光互补（Bi-molecular Fluorescence Complementary, BiFC）通过将荧光蛋白（如Venus或YFP）分割为两个无荧光活性的片段（VN和VC），分别与待测蛋白X/Y融合表达。当X与Y发生互作时，VN和VC片段因空间邻近重构完整荧光蛋白结构，在激发光下发射特征荧光表征蛋白互作情况。

✅技术流程

（1）分别构建目的蛋白和待测试蛋白的融合表达质粒；

（2）将两个表达质粒共转染至细胞；

（3）通过荧光显微镜或者流式细胞仪检测细胞阳性信号；

✅技术优势

🔥可实时监测活细胞内蛋白互作的时空动态；

🔥通过荧光信号直接定位互作发生的细胞器或区域；

🔥具有高灵敏度与特异性，显著降低假阳性；

🔥能够用于弱/瞬时互作捕获；

🔥可通过多色荧光蛋白分割实现多对互作同步分析。

（体内水平，加分指数☆☆）

荧光素酶互补实验（Luciferase Complementation Assay, LCA）基于荧光素酶（如Firefly Luciferase）被拆分成的两个无活性片段（N-Luc与C-Luc），分别与靶蛋白A和B融合。当A与B发生互作时，N-Luc与C-Luc因空间邻近恢复酶活性，催化底物荧光素氧化并产生可检测的生物发光信号，其强度与蛋白互作程度正相关。

✅技术流程

（1）分别将N-Luc和C-Luc分别连接至靶蛋白A/B构建融合表达质粒；

（2）将质粒共转染至细胞并培养；

（3）加入荧光素底物，通过化学发光仪检测发光强度。

✅技术优势
🔥实时定量检测活细胞或体内互作动态；
🔥无需裂解细胞，保留天然互作环境；
🔥高通量兼容性，适用于药物筛选或突变体互作分析；
🔥灵敏度高，可检测弱/瞬时互作。

（体内水平，加分指数☆☆☆☆☆）

荧光共振能量转移（Fluorescent Resonance Energy Transfer，FRET）是指当两个荧光发色基团在足够靠近时，以特定波长的光激发供体分子能够通过偶极子相互作用将能量转移到邻近的受体分子，并使其能量发生变化，产生荧光，实现能量共振转移。

✅技术流程

（1）分别构建带有不同荧光标签的目的蛋白和待测蛋白表达质粒；

（2）将表达质粒转染至细胞并培养；

（3）根据分析流程分别进行荧光激发和信号采集；

（4）荧光显微镜采集图像并分析FRET效率。

✅技术优势

🔥细胞活体生理状态下检测分子间相互作用或者分子构象变化；

🔥将蛋白互作信号转化为荧光信号，实现蛋白互作可视化；

🔥荧光信号灵敏度高，可实现单细胞检测；

🔥可检测单个分子的构象变化；

🔥能够与多种仪器或者技术方法结合，如与高分辨率显微镜、流式细胞仪、色谱技术等联合使用。

（体内水平，加分指数☆☆☆☆☆）

邻位连接实验（Proximity Ligation Assay，PLA）是利用不同种属的特异性抗体分别识别靶蛋白和待测试蛋白，使用偶联特异性寡核苷酸探针（PLA探针）的二抗结合一抗，PLA探针经滚环扩增（RCA）进行荧光标记，通过荧光显微镜检测荧光信号分析蛋白互作。

✅技术流程

（1）准备组织切片或者固定好的细胞样本；

（2）使用不同种属的抗体结合目的蛋白和待检测蛋白；

（3）加入带有PLA探针的二抗与一抗结合；

（4）PLA探针形成连接子并进行滚环扩增；

（5）使用荧光显微镜进行可视化检测和分析；

✅技术优势

🔥兼具ELISA的特异性和荧光PCR的灵敏度；

🔥将蛋白互作信息转化为荧光信号，实现蛋白互作可视化

🔥通过DNA扩增放大蛋白互作信号，灵敏度高，可检测瞬时蛋白互作；

🔥可进行蛋白磷酸化、乙酰化等修饰检测；

🔥可应用于病理切片或大规模样本检测；

（体内水平，加分指数☆☆☆☆）

邻近标记技术（Proximity Labeling, PL）将具有邻近标记功能的酶（如过氧化氢酶APEX、APEX2和HRP；生物素连接酶BioID、Turbo ID以及BASU等）与目标蛋白融合，通过邻近标记酶催化的共价修饰的方式将生物素标记到目的蛋白附近的蛋白分子上，从而分析与目的蛋白存在相互作用的蛋白信息。

✅技术流程

（1）构建目的基因与生物素连接酶的融合蛋白表达质粒；

（2）WB检测融合表达质粒蛋白表达效果；

（3）将融合表达质粒转染至细胞；

（4）转染48 h后加入适量生物素孵育；

（5）收集细胞并提取总蛋白；

（6）利用链霉亲和素-琼脂糖富集生物素标记的蛋白；

（7）Western blot检测或者质谱鉴定。

✅技术优势

🔥生物素结合特亲和力强；

🔥不依赖IP级别的抗体和体外纯化的蛋白；

🔥具有空间分辨率，能够检测分子间的动态相互作用；

🔥能够实现原位标记，分析互作的空间性；

🔥能够检测瞬时相互作用或弱相互作用；

（体外水平，加分指数☆☆☆）

酶联免疫吸附实验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA）利用双抗体夹心法定量检测蛋白互作。将捕获抗体固定于酶标板，捕获目标蛋白A后加入蛋白B，若二者互作，则通过检测抗体（偶联酶标记物）特异性识别蛋白B，加入底物后酶催化显色反应，光密度值与互作强度成正比。

✅技术流程

（1）将蛋白A的捕获抗体包被于酶标板；

（2）使用BSA封闭非特异性位点；

（3）加入蛋白A与待测蛋白B共孵育；

（4）加入酶标检测抗体及底物进行显色；

（5）终止反应，使用酶标仪测定OD值。

✅技术优势

🔥高灵敏度，适用于低丰度蛋白互作检测；

🔥高通量，支持批量样本同步检测；

🔥操作简单，标准化试剂盒及流程；

🔥精准定量，标准曲线实现互作强度的定量比较；

🔥低样本消耗，适合珍贵或微量样本；

🔥高特异性，通有效降低非特异性结合干扰；